【知识课堂】详解PBMC分离实验
什么是PBMC?
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，由不同比例的淋巴细胞 (T细胞、B细胞和NK细胞)、单核细胞和其他少数类型细胞组成的细胞群 。这些细胞是先天免疫和适应性免疫系统的关键组成部分, 可以保护身体免受病毒、细菌和寄生虫的感染和异物侵扰, 并且能够消灭肿瘤细胞。因此其在免疫学、传染病、恶性肿瘤、疫苗研发、移植治疗、个性化医学和毒理学等领域作为最基础的实验原料被广泛使用。
PBMC分离方法及原理
目前PBMC主要的分离方法是Ficoll密度梯度离心法，即根据密度差异从而将不同的物质分离。PBMC与其他细胞在体积、形态和密度等特性上存在差异，当使用一种密度介于1.075g/mL～1.092g/mL之间且近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，某种密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
分离时先将分离液置于试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，而与分离液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分离液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞洗涤、重悬。
品牌: LABSELECT
货号: CTL-002-15-S
名称: 15ml外周血淋巴细胞分离管灭菌
品牌: LABSELECT
货号: CTL-002-50-S
名称: 50ml外周血淋巴细胞分离管灭菌
品牌：Biosharp
货号：BL590
名称：人外周血淋巴细胞分离液
品牌：Biosharp
货号：BL1420A
名称：人外周血淋巴细胞分离液
品牌：Biosharp
货号：BL1821A
名称：小鼠外周血淋巴细胞分离液
品牌：Biosharp
货号：BL1822A
名称：大鼠外周血淋巴细胞分离液
将分离液、样本及缓冲液的温度平衡至室温,分离液注意避光。
将分离液用移液管从分离管支架的中心孔中加入：15ml的分离管需要加入约4ml分离液;50ml的分离管需要加入约13ml分离液，确保分离液覆盖支架上方。
将抗凝样本(血或骨髓，如果需要可以用生理盐水稀释)沿管壁倒入或用移液管沿管壁加入到分离管中(15ml分离管建议加4-9ml样本；50ml分离管建议加13-30ml样本)。
室温下离心1200 g,10分钟；对于超过 24小时的样品,建议离心时间为20分钟。(可根据具体实验调整转速和时间，摸索最佳的分离条件)。
离心后液体从上到下分层情况为：血浆；富集细胞(淋巴细胞/PBMC细胞)；分离液；分离支架；沉淀(红细胞和粒细胞)。
收集富集细胞(淋巴细胞/PBMC细胞)：将分离管中上清倒入另一干净离心管中，分离管中的支架能有效避免富集细胞被红细胞和粒细胞再次污染。建议不要将分离管倒置2s以上。
用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤富集细胞(淋巴细胞/PBMC细胞)，离心250 g，10分钟。重复洗涤2次，最后用5mI PBS缓冲液重新悬浮。
稀释血液可以降低血液黏稠度以及红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。
温度变化会直接影响分层液的密度，进而影响细胞的收获率和纯度。故应在室温（18-25°C）进行实验，分层液使用前应预热至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。
分离时转速和时间应根据不同样品做相应调整，离心后若在白雾状细胞层中掺杂红细胞，则提高转速或延长离心时间。若淋巴细胞丢失过多，则应适当降低转速或离心时间。
分层液应直接加入离心管底部，防止浸润四周管壁。将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。
为保证细胞活力，操作过程尽量轻柔，避免对细胞造成机械损伤，并尽量缩短实验时间。
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